在过往的研究中，原代细胞和永生化细胞系的二维(2D)单层培养物已被广泛用于药物筛选和疾病建模。但是普通的2D细胞培养存在一些缺点，如组织特异性结构丢失、细胞分化缺失和屏障完整性受损，这些特征在研究呼吸系统疾病时都非常重要。
气-液界面（Air-Liquid Interface, ALI）培养被认为是呼吸系统生理学高度相关的培养体系，能够克服2D培养的许多挑战。
它使培养物的一侧与液体培养基接触，另一侧则有空气包围，所以气液界面(ALI)非常适合研究与液体和空气相互作用的呼吸道上皮细胞。与使用传统细胞培养模型相比，ALI系统帮助研究人员更准确地模拟体内环境。这使得它们非常适合进行呼吸道上皮细胞作为药物渗透屏障的机制研究；研究基本的皮肤过程，例如伤口愈合；并促进对包括严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)在内的呼吸道上皮感染的了解。从哮喘到慢性阻塞性肺病，ALI模型在研究呼吸系统疾病方面一直备受重视。随着最近COVID-19病毒的爆发和严重程度，这项技术在研究和治疗疾病中变得更加重要。
ALI的培养方式往往需要可穿透性小室的支持，康宁的Transwell/Insert为ALI培养提供了简单易行的操作方法，大大提高了实验的成功率。
本期，小C将与大家分享康宁的可穿透小室在气道模型构建过程中的应用示例。
多种细胞类型可用于呼吸系统模型的构建，以下分别是使用来源于健康供体和患有囊性纤维化疾病供体的原代支气管上皮细胞（NHBE和D-HBE-CF）以及细胞系Calu-3构建气道模型。
实验方法
将NHBE和D-HBE-CF分别接种于预包被了I型鼠尾胶原的Transwell小室内，小室膜孔径0.4um，材质PET。在小室内以及下室接收孔中分别添加培养基，以液-液的形式培养6天直至形成致密的单细胞层后，将上下室的培养基全部吸掉，并且仅在下室添加分化培养基。以气-液形式培养28-30天，每周更换3次培养基，并且每周1次使用DPBS冲洗小室去除粘液。培养结束后，检测电阻值，并对细胞进行染色和成像。
实验结果
两种来源的支气管上皮细胞，经ALI培养后均形成了可模拟天然支气管组织的具有睫状刷边界的假复层上皮，并含有产生粘液的杯状细胞，且观察到了纤毛摆动（见图1，图2，Scale bar =10um）。
图1：HE染色显示经ALI培养28-30天后NHB和D-HBE-CF原代支气管上皮细胞形成假复层上皮
图2：ALI培养的假复层上皮含有产生粘液的杯状细胞,黑色箭头所指示
重要的是，对于健康和受囊性纤维化影响的支气管上皮细胞，在ALI 培养过程中不仅分化出了这3种细胞，而且这些细胞的组织方式类似于完整的气道上皮组织，纤毛细胞出现在顶端（空气）侧，基底干细胞出现在基底外侧（液体）侧（图3，Scale bar =10um）。
图3：在ALI培养的NHBE和D-HBE-CF原代支气管上皮细胞形成含有3种分化细胞类型的假复层上皮细胞。IF染色表明，来自两个供体的ALI培养物含有纤毛细胞（Beta-IV微管蛋白）、产生粘液的杯状细胞（Muc5AC）和基底细胞（p63）
实验方法
将Calu-3细胞接种在Transwell小室中，小室膜孔径0.4um，聚碳酸酯（PC）膜和聚酯（PET）膜均可用于本实验。上下室均加入培养基，以液-液形式培养过夜培养。24小时后，将其中ALI组内小室中的培养基去除，仅在下室添加培养基，以气-液界面的形式培养，另外一部分小室仍以液-液形式培养。每2～3天更换培养基，培养3周。跨膜电阻（TEER）值每2至3天测量一次，以确认细胞之间是否形成紧密连接，并使用荧光黄（Lucifer Yellow）染料进行渗透性测试，以检测细胞层的完整性。ALI培养结束后对细胞进行固定和HE染色。（实验流程参考，图1）。
图1：实验流程
实验结果
TEER值以及 Lucifer Yellow通透性检测结果显示，Calu-3细胞在ALI培养的条件下，TEER值在1周内达到高值，然后下降并稳定在大约300Ω•cm2，Papp远低于1 x 10-6cm/s，在3周内细胞之间形成紧密连接。（图2）
图2：气液模型中Calu-3的TEER测量值,左图；培养1周和3周后Calu-3上皮模型的荧光黄通透性，右图
HE染色结果表明，经ALI培养3周后，Calu-3细胞形成了假复层柱状上皮。而在 液-液培养中表现出较差的形态质量。在液-液模型中，细胞未见分化，形态扁平，鲜见纤毛和分泌突起；在气-液模型中，细胞高度极化、融合，并保留了纤毛细胞和分泌细胞的混合物（图3，Scale bar =50um）。
图3：培养1周和3周后，L-L和A-L界面处的Calu-3 HE染色情况。L-L界面处显示扁平细胞单层(A, B)。在A-L界面，形成假复层粘液纤毛上皮形态（C，D）
在ALI培养3周的细胞中可见分泌产物和囊泡（图4，Scale bar =50um）。
图4：中性蛋白聚糖用 PAS（Periodic Acid-Schiff）染色（红色），细胞核用核固红染色（图 4，左图）。 酸性蛋白聚糖用阿尔新蓝（Alcian Blue）染色（蓝色）（图 4，右图）
通过在气液界面培养人气管支气管上皮细胞、原代细胞和细胞系，均可以帮助气道生物学的研究。这里我们验证了使用康宁可穿透小室可以支持几种不同的细胞构建体外的气道模型。并使用几种方法来验证该模型的完整性，包括测量TEER值和渗透性。
下一期，我们将跟大家介绍基于ALI构建皮肤模型的方法。
文章来源于康宁生命科学
