在确定质粒与转染试剂的比例后，对包装病毒所需的多质粒条件进行摸索。在多质粒共转染时，根据目的基因不同，对于各个质粒的添加量会选择不同的比例，这里我们慢病毒包装体系使用的是三质粒包装系统（pHBLV-U6-CMV-ZsGreen、psPAX2和pMD2.G），目的基因为ZsGreen，病毒产量通过产出慢病毒滴度进行计算。据文献报道，慢病毒包装体系中pMD2.G质粒用量所占比例较低。在此基础上，我们继续使用DOE对其它质粒用量进行优化。如图2所示我们进行了各质粒添加量测试，结果显示最佳质粒比例为 4:2:1 (pHBLV-U6-MSC-CMV-ZsGreen: psPAX2: pMD2.G)。

在不同贴壁培养容器中进行慢病毒包装生产，并对各容器生产慢病毒的滴度进行检测与比较（图3）。293T细胞在康宁T-25 CellBIND flask (Corning, Cat. No. 3289) 中复苏，并在康宁T-175 CellBIND flask (Corning, Cat. No. 3292)及HYPERFlask (Corning; Cat. No. 10024) 中进行扩增，最后将细胞接种至康宁T-25 CellBIND flask，HYPERStack Vessel-12 (Corning; Cat. No. 20012) 和2层CellSTACK细胞工厂 (Corning; Cat. No. 3310)中进行质粒瞬时共转染，包装生产慢病毒，分别在48小时和72小时后，收集上清，混匀两次收获上清，并检测其所含病毒滴度，计算慢病毒产量。