| 小C讲堂第10讲——如何高效冻存类器官 | |||
|
肿瘤类器官模型作为极具潜力的临床前模型，在病理学研究，治疗方法开发以及药物敏感性检测方面有很多应用。因此，建立类器官生物样本库可以为类器官基础研究、药物开发以及个体化治疗提供更为可靠的工具。 建立类器官生物样本库对于类器官的冻存与复苏提出了很高的要求，在保证类器官最佳生长状态的前提下，优良的冻存培养基是类器官冻存与复苏成功的关键。 本期讲堂，小C向您按头安利Corning KM Banker II（Corning Cat.No.88-702-CB）无血清冻存培养基！KM Banker II以其优良的冻存复苏效果已成功应用于多种类器官的冻存，并且无须程序降温，可以直接冻存，省时又省力。具体的类器官冻存与复苏步骤且听小C娓娓道来。
肠癌类器官冻存步骤 注意: 肠癌类器官与正常肠类器官培养是有差异的，培养时间会更长，培养条件会更严苛；肠癌类器官状态不佳时，进行传代或冻存会影响后续观察性实验或导致复苏失败；因此冻存前的肠癌类器官必须处在最佳生长状态（即一般6-9天可以进行传代，传代成活率95%以上，例如图A,B）；其次优良的冻存液也是保证肠癌类器官复苏成功的必要条件。 1.肠癌类器官冻存前24小时更换新鲜类器官培养基；准备含有0.1%BSA 的冰PBS (Corning Cat.No.21-040-CV）； 2.对24孔培养板 (Corning Cat.No.3524)每个孔中的肠癌类器官数目进行计数，一般一支2ml的冻存管（Corning Cat.No.430659）冻存200-300个类器官； 3.去除孔中培养基，加入1ml预冷的含0.1%BSA 的PBS，轻柔吹打3-5次，将 Matrigel（Corning Cat.No.356231）从板底吹起并打碎，将悬液移入15ml离心管中； 4.将类器官在4℃，300-500 x g离心5分钟，去除上清，加冰PBS重悬，重复清洗过程3-5次直至胶去除干净； 5.最后一次离心后，将上清去除干净；依据200-300个类器官/500μl冻存液（Corning Cat.No.88-702-CB）比例加入相应体积的冻存液； 轻柔重悬类器官后取500μl转移入冻存管，标记好直接移入-80℃冰箱，无需冻存盒梯度降温；经此方法冻存的类器官可在-80℃短期保存1个月，长期保存可转入液氮罐中（请将冻存管存放于液氮罐的气相）。
A:肠癌类器官（多形态）；B：肠癌类器官（线圈型）50X
肠癌类器官复苏步骤 1.冰上解冻Matrigel（Corning Cat.No.356231）；首次解冻请将原瓶埋在碎冰中于4℃冰箱过夜，并按单次用量分装，避免反复冻融；相应的肠癌培养基恢复到室温；24孔板置于37℃培养箱预热30分钟； 2.准备10%FBS DMEM/F12 (Corning Cat.No.10-092-CV),准备0.1%BSA 的冰PBS及Y27632(10mM)； 3.向15ml离心管中预先加入5ml平衡至室温的含10%FBS的DMEM/F12 ，各离心管提前标记复苏的类器官； 4.从液氮罐中取出冻存管，37℃水浴锅解冻，解冻时间1-2分钟，最佳解冻状态为：冻存管中大部分为液体状态，中间稍微有一点冻滴，即冻存管中依然为低温状态（过度升温影响类器官活性）； 5.使用1ml枪头，将解冻的类器官悬液转入上述步骤3中的15ml离心管中； 6.类器官悬液4℃，300-500 x g离心5分钟，弃上清； 7.用0.1%BSA的冰PBS重悬类器官，轻柔吹打，4℃，300-500 x g离心5分钟，弃上清； 8.将200 μl Matrigel加入离心管中，上下吹打重悬均匀类器官，此过程尽量避免因吹打而引入气泡，否则会影响后续接种； 9.使用预冷的200ul枪头，加50μl类器官Matrigel悬液至预热的24孔板 (Corning Cat.No.3524)中，在每孔中心形成圆顶液滴，接种完成后放入培养箱5-10分钟使胶滴固化； 10.向已接种胶滴的培养孔沿壁加入500-750μl相应的肠癌类器官培养基，加液时勿直接冲击胶滴或沿壁加液速度过快而使胶滴脱离板底； 11.复苏后的首次加液时向培养基中添加Y27632（终浓度10μM），后续每3-4天换液一次（无需再添加Y27632），一般1-3周肠癌类器官可进行首次传代，依据传代效果可安排进行相应的实验。
注意事项 肠癌类器官复苏的关键在于： 1.冻存时肠癌类器官的活力状态； 2.冻存液的有效性； 3.相适应的类器官培养基
A:复苏后第1天；B：复苏后第4天；C：复苏后第7天；D:复苏后第10天；50X
特别感谢：复旦大学放射医学研究所徐小雅老师实验室提供案例分享
订购信息
文章来源于康宁生命科学 | |||
|
